Tin tức

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) là một chất tương tự của cơ chất β-galactosidase, rất dễ cảm ứng.Dưới tác dụng của IPTG, chất cảm ứng có thể tạo thành một phức hợp với protein ức chế, do đó cấu hình của protein ức chế bị thay đổi, do đó nó không thể kết hợp với gen mục tiêu và gen mục tiêu được biểu hiện một cách hiệu quả.Vậy nồng độ IPTG nên được xác định như thế nào trong quá trình thí nghiệm?Là càng lớn càng tốt?
Trước tiên, hãy hiểu nguyên tắc cảm ứng IPTG: Operon (yếu tố) lactose của E. coli chứa ba gen cấu trúc Z, Y và A, tương ứng mã hóa cho β-galactosidase, permease và acetyltransferase.lacZ thủy phân lactose thành glucose và galactose, hoặc thành allo-lactose;lacY cho phép đường lactoza trong môi trường đi qua màng tế bào và đi vào trong tế bào;lacA chuyển nhóm acetyl từ acetyl-CoA sang β-galactoside, liên quan đến việc loại bỏ hiệu ứng Toxic.Ngoài ra, còn có trình tự vận hành O, trình tự khởi động P và gen điều hòa I. Mã gen I là prôtêin ức chế có thể liên kết với vị trí O của trình tự vận hành, do đó operon (meta) bị ức chế và tắt.Ngoài ra còn có một vị trí liên kết cho vị trí liên kết protein-CAP của chất kích hoạt gen dị hóa ngược dòng của trình tự khởi đầu P. Trình tự P, trình tự O và vị trí liên kết CAP cùng nhau tạo thành vùng điều hòa của operon lac.Các gen mã hóa của ba enzym được điều hòa bởi cùng một vùng điều hòa để đạt được sự biểu hiện phối hợp của các sản phẩm gen.

Khi không có đường sữa, operon lac (meta) ở trạng thái bị ức chế.Lúc này, chất ức chế lac được biểu hiện bởi trình tự I dưới sự kiểm soát của trình tự khởi động PI liên kết với trình tự O, ngăn cản RNA polymerase liên kết với trình tự P và ức chế sự bắt đầu phiên mã;khi có lactoza, operon lac (meta) có thể được cảm ứng Trong hệ thống operon (meta) này, chất cảm ứng thực sự không phải là bản thân lactoza.Lactose đi vào tế bào và được xúc tác bởi β-galactosidase để chuyển thành allolactose.Loại thứ hai, với tư cách là một phân tử cảm ứng, liên kết với protein ức chế và thay đổi cấu trúc protein, dẫn đến sự phân ly protein ức chế khỏi trình tự O và quá trình phiên mã.Isopropylthiogalactoside (IPTG) có tác dụng tương tự như allolactose.Nó là chất cảm ứng rất mạnh, không bị vi khuẩn chuyển hóa và rất bền nên được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm.

Làm thế nào để xác định nồng độ tối ưu của IPTG?Lấy vi khuẩn E. coli làm ví dụ.
Chủng biến đổi gen E. coli BL21 chứa pGEX tái tổ hợp dương tính (CGRP/msCT) được cấy vào môi trường lỏng LB chứa 50μg·mL-1 Ampe và được nuôi cấy qua đêm ở 37°C.Dịch cấy trên được cấy vào 10 chai 50mL môi trường lỏng LB tươi chứa 50μg·mL-1 Ampe với tỷ lệ 1:100 để nuôi cấy mở rộng và khi giá trị OD600 là 0,6~0,8, IPTG được thêm vào nồng độ cuối cùng.Đó là 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1.Sau khi cảm ứng ở cùng nhiệt độ và cùng thời gian, 1 mL dung dịch vi khuẩn được lấy ra khỏi đó và các tế bào vi khuẩn được thu thập bằng cách ly tâm và chịu SDS-PAGE để phân tích ảnh hưởng của các nồng độ IPTG khác nhau đối với biểu hiện protein, sau đó chọn nồng độ IPTG có biểu hiện protein lớn nhất.
Sau các thí nghiệm, người ta thấy rằng nồng độ IPTG không phải là lớn nhất có thể.Điều này là do IPTG có độc tính nhất định đối với vi khuẩn.Vượt quá nồng độ cũng sẽ giết chết tế bào;và nói chung, chúng tôi hy vọng rằng càng nhiều protein hòa tan được biểu hiện trong tế bào thì càng tốt, nhưng trong nhiều trường hợp khi nồng độ IPTG quá cao, một lượng lớn tạp chất sẽ được hình thành.Cơ thể, nhưng lượng protein hòa tan giảm.Vì vậy, nồng độ IPTG phù hợp nhất thường không phải càng lớn càng tốt mà là nồng độ càng thấp.
Mục đích của việc cảm ứng và canh tác các chủng biến đổi gen là để tăng sản lượng protein mục tiêu và giảm chi phí.Sự biểu hiện của gen mục tiêu không chỉ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố của chủng và plasmid biểu hiện, mà còn bởi các điều kiện bên ngoài khác, chẳng hạn như nồng độ của chất cảm ứng, nhiệt độ cảm ứng và thời gian cảm ứng.Vì vậy, nhìn chung, trước khi biểu hiện và tinh chế một protein chưa biết, tốt nhất nên nghiên cứu thời gian cảm ứng, nhiệt độ và nồng độ IPTG để chọn điều kiện thích hợp và thu được kết quả thí nghiệm tốt nhất.