Các sản phẩm

Hiểu được quá trình trao đổi chất của vật chủ vi sinh vật là điều cần thiết để phát triển và tối ưu hóa các quy trình xúc tác sinh học dựa trên toàn bộ tế bào, vì nó quyết định hiệu quả sản xuất.Điều này đặc biệt đúng đối với quá trình xúc tác sinh học oxi hóa khử trong đó các tế bào hoạt động trao đổi chất được sử dụng do khả năng tái tạo đồng yếu tố/đồng cơ chất nội sinh trong vật chủ.Escherichia coli tái tổ hợp đã được sử dụng để sản xuất thừa proline-4-hydroxylase (P4H), một dioxygenase xúc tác quá trình hydroxyl hóa L-proline tự do thành trans-4-hydroxy-L-proline với a-ketoglutarate (a-KG) làm chất đồng nền.Trong chất xúc tác sinh học toàn tế bào này, quá trình chuyển hóa carbon trung tâm cung cấp a-KG cơ chất cần thiết, liên kết hiệu suất xúc tác sinh học P4H trực tiếp với quá trình chuyển hóa carbon và hoạt động trao đổi chất.Bằng cách áp dụng cả hai công cụ sinh học thực nghiệm và tính toán, chẳng hạn như kỹ thuật trao đổi chất và (13)phân tích dòng chuyển hóa C ((13)C-MFA), chúng tôi đã nghiên cứu và mô tả định lượng phản ứng sinh lý, trao đổi chất và năng lượng sinh học của chất xúc tác sinh học toàn tế bào chuyển đổi sinh học mục tiêu và xác định các tắc nghẽn chuyển hóa có thể xảy ra đối với kỹ thuật con đường hợp lý hơn nữa. Một chủng vi khuẩn E. coli thiếu phân hủy proline được tạo ra bằng cách xóa proline dehydrogenase mã hóa gen putA.Biến đổi sinh học toàn tế bào với chủng đột biến này không chỉ dẫn đến quá trình hydroxyl hóa proline định lượng mà còn tăng gấp đôi tỷ lệ hình thành trans-4-L-hydroxyproline (hyp) cụ thể, so với loại hoang dã.Phân tích dòng carbon thông qua quá trình trao đổi chất trung tâm của chủng đột biến cho thấy nhu cầu tăng a-KG đối với hoạt động P4H không tăng cường dòng tạo a-KG, cho thấy hoạt động chu trình TCA được điều chỉnh chặt chẽ trong các điều kiện nghiên cứu.Ở chủng dại, quá trình tổng hợp và xúc tác P4H làm giảm sản lượng sinh khối.Điều thú vị là chủng ΔputA đã bù đắp thêm cho sự mất mát ATP và NADH có liên quan bằng cách giảm nhu cầu năng lượng duy trì ở tốc độ hấp thu glucose tương đối thấp, thay vì tăng hoạt động TCA. Việc loại bỏ putA trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)(pLysS) tái tổ hợp đã được phát hiện là hứa hẹn cho xúc tác P4H hiệu quả không chỉ về năng suất chuyển hóa sinh học, mà còn liên quan đến tốc độ chuyển hóa sinh học và hấp thu proline và năng suất hyp đối với nguồn năng lượng.Kết quả chỉ ra rằng, sau khi loại bỏ putA, việc ghép chu trình TCA với quá trình hydroxyl hóa proline thông qua cosubstrate a-KG trở thành yếu tố chính hạn chế và là mục tiêu để cải thiện hơn nữa hiệu quả của các chuyển đổi sinh học phụ thuộc vào a-KG.